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O Tribunal do Santo Ofício foi introduzido em Portugal em 1536, tendo a primeira Inquisição sido instalada em Évora.

Ao longo dos tempos, o Palácio da Inquisição sofreu diversas obras de ampliação e adaptação do edifício para vários fins, pelo que a sua estrutura atual é muito diferente da primitiva.

No tempo do Cardeal-Rei D. Henrique, Arcebispo de Évora e Inquisidor-Geral, ampliou-se muito o edifício, chegando a ligar-se os cárceres à parede ocidental do Açougue - o famoso Templo Romano, transformado em matadouro na Idade Média.

Entre 1622 e 1655, foram novamente feitas grandes obras de ampliação do edifício e ajustamento à sua função, sendo a empreitada final da traça do Arquitecto-Mor das Inquisições do Reino, Mateus do Couto. A sua planta encontra-se no Livro das plantas dos palácios das Inquisições do Reino, no Arquivo Nacional da Torre do Tombo, em Lisboa.

No interior do edifício, destacam-se dois compartimentos, que ainda hoje se conservam, e que merecem a atenção do visitante ou do investigador: a Sala do Tribunal e o Cubículo do Inquisidor.

A primeira, do século XVII, é de planta retangular de grandes dimensões e pé alto direito, iluminada por seis janelas com moldura de granito, protegidas com grades de ferro forjado negro. As paredes são rematadas por um rodapé alto de azulejos finamente decorados, em azul e branco; mas é o teto barroco, de carvalho, que prende o olhar, com os seus caixotões retangulares e de losangos, ostentando ao centro emblema do Santo Ofício: cruz ladeada por uma oliveira e um punhal.

Das janelas laterais desta sala pode olhar-se para o jardim das Casas Pintadas e entrever, nas paredes para lá das laranjeiras e dos limoeiros, um singular conjunto de pinturas a fresco da 1ª metade do século XVI.

O Cubículo do Inquisidor, no segundo andar, conserva como mais significativo um teto de madeira com pinturas cronografado de 1712, apresentando ao centro as armas dos Francos ou Cortezes.

Extinta a Inquisição em 1821, o edifício foi comprado pelos Duques de Palmela em 1845; serviu de pousada ao lavrador Diogo Maldonado Pessanha no início do século XX e, após nova readaptação, ali funcionou, entre 1928 e 1949, o Hotel Alentejano. Em 1961 foi adquirido por Vasco Maria Eugénio de Almeida, Instituidor da Fundação Eugénio de Almeida, e todo remodelado para albergar o ISESE - Instituto Superior Económico e Social de Évora, percursor da reabertura da Universidade de Évora 200 anos após o seu encerramento.

Depois da suspensão definitiva das atividades letivas do ISESE, em 1977 a Fundação estabeleceu com o então Instituto Universitário de Évora e atual Universidade, um acordo de cedência gratuita das instalações, que terminou em 2005.

No âmbito de um grande projeto de requalificação do seu património monumental no Centro Histórico de Évora, em 2013 a Fundação deu uma nova vocação ao Palácio da Inquisição, que funciona hoje como um Centro de Arte e Cultura.